Los actinomicetos son un grupo de bacterias Gram positivas cuya importancia biotecnológica radica en su capacidad de producir un gran número de metabolitos secundarios, entre los que se encuentran los antibióticos. Streptomyces avermitilis produce 28 metabolitos secundarios entre los que destacan por su interés industrial las avermectinas y la oligomicina. Las avermectinas son empleadas en medicina y agricultura, debido a sus propiedades antiparasitarias y antihelmínticas, aunque también se han reportado con actividad antibacterial y antifúngica si se usan en altas concentraciones (Egerton et al., 1979; Chen et al., 2008). La oligomicina es un compuesto que muestra una amplia variedad de actividades biológicas, especialmente un fuerte efecto antifúngico por inhibición específica de la ATPasa mitocondrial, actividad inmunosupresora (Wei et al., 2006), y una potente actividad antitumoral contra hepatoma humano, leucemia mielógena crónica y varios tipos de células de carcinoma colónico (Xiuping et al., 2009). Debido a lo anterior se han incrementado los estudios para el mejoramiento genético de este microorganismo. Por otro lado, se han encontrado genes involucrados en la resistencia y exportación de los antibióticos propios de cada microorganismo productor. Se ha demostrado que puede presentarse un efecto tóxico propio de la actividad del antibiótico que sintetizan cuando las concentraciones del mismo son altas lo que marca un límite en la producción en cepas industriales de alta producción. En este sentido se han identificado en muchos actinomicetos proteínas de membrana que funciona como una bomba exportadora de antibiótico. Tal es el caso de Streptomyces pristinaespiralis, productor de pristinamicina en quien el gen ptr codifica una proteína responsable de la exportación de dicho antibiótico mediante un sistema antiport, pristinamicina/proton (Folcher et al., 2001). Con estos antecedentes, se buscó una proteína similar en S. avermitilis y mediante análisis insílico se encontró que el gen SAV4194 contiene 13 dominios transmembranales típicos de proteínas transportadoras además, se identificó que presenta 78% de similitud con el gen Ptr de S. pristinaespiralis y 74% con el gen RifP de A. mediterranei. Tanto el gen Ptr como el gen RifP codifican para proteínas transportadoras de antibióticos (Folcher et al., 2001; Absalón et al., 2007). En base a esta similitud es que consideramos que el gen SAV4194 también codifica para una proteína de transporte. Para probar la hipótesis, se plantearon dos estrategias. La primera fue interrumpir el gen SAV4194 mediante el transposón Tn5062. Para esto fue necesario en principio, amplificar el gen mediante PCR, posteriormente clonarlo en el plásmido pME6 e interrumpir con el transposón el gen ya clonado. Finalmente se trató de transformar a S. avermitilis con este nuevo vector para que mediante recombinación homóloga el gen interrumpido se integrara al cromosoma; con lo cual se obtendrían mutantes con el gen SAV4194 interrumpido. Sin embargo, no fue posible transformar por ninguna de las técnicas reportadas la cepa de S. avermitilis con la cual se trabajó lo que nos llevó a la conclusión de que el problema se debía a que se ha reportado que este microorganismo tiene un sistema de restricción muy fuerte (Macneil et al.,1998, Hwang et al., 2001, Gong et al., 2004). Por lo tanto, fue necesario implementar una estrategia alternativa para obtener información que nos permitiera responder la pregunta original del presente trabajo de tesis, sobre si este gen codifica o no para una proteína transportadora de avermectinas. Ésta consistió en evaluar la expresión del gen durante la trofofase e idiofase de S. avermitilis en diferentes medios de cultivo (medio semilla, medio de producción de oligomicina y medio de producción de avermectina). Las muestras de ARN se estudiaron mediante métodos cualitativos (RT-PCR) y cuantitativos (QRT-PCR). Tanto los resultados de RT-PCR como los de PCR en tiempo real mostraron que el gen SAV4194 no se expresa durante la producción de avermectinas pero si se expresa durante la producción de oligomicina. Por lo tanto, la no expresión del gen SAV4194 en el medio de producción de avermectina demuestra que este gen no está involucrado en su exportación. Y la expresión del gen SAV4194 en los medios donde hay producción de oligomicina sugiere que este gen podría estar implicado en el transporte de oligomicina hacia el exterior de la célula.
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