Clonación y caracterización de fragmentos RAPD y loci microsatélite, asociados a Psidium guajava L. cultivada en 4 estados de la República Mexicana Público Deposited
Introducción. El gran número de habitantes en el mundo que utilizan a las plantas medicinales como recurso para solucionar sus problemas de salud, atrae la atención de instancias gubernamentales e internacionales que establecen métodos de control de calidad para garantizar su seguridad y eficacia. Los documentos oficiales reconocen como pruebas de autenticidad, a las de identificación taxonómica y de compuestos químicos que son característicos de la especie; sin embargo, en años recientes se están empleando marcadores de ADN para la identificación de la especie y discriminación de adulterantes. Entre los marcadores de ADN se encuentran los del tipo RAPD, RFLP, AFLP, secuencia específica y microsatelital. La hoja de guayaba (Psidium guajava L.) ampliamente cultivada en México, se utiliza popularmente en el tratamiento de trastornos estomacales y estudios clínicos recientes demuestran su eficacia en el tratamiento del síndrome de colon irritable. Planteamiento del problema. Debido a la escasa información genética existente de P. guajava, el presente trabajo se enfocó en la obtención de marcadores genéticos que se relacionen con la acumulación de quercetina y permitan la autentificación de la especie, como una herramienta en el control de calidad en el desarrollo de fitofármacos. Hipótesis. Algunas variaciones en regiones del ADN entre individuos de P. guajava cultivados en diferentes estados de la República Mexicana están asociadas a la acumulación de flavonoides mientras que las regiones conservadas lo están con la identificación de la especie. Objetivos. a) Caracterizar las variaciones u homologías de secuencia en segmentos tipo RAPD provenientes del ADN genómico de P. guajava L.; b) Obtener la distribución de la frecuencia alélica de diferentes muestras de P. guajava L. a partir de la construcción de una biblioteca genómica de loci microsatélite de la clase dinucleótida. Materiales y Métodos. Retoños limpios se colectaron en 40 árboles en cuatro estados de la República Mexicana. El material vegetal se procesó para obtener por un lado un extracto metanólico hidrolizado para la cuantificación de quercetina por HPLC usando columnas RP-18 y un detector PDA, y por otro lado se obtuvo ADN genómico. En éste se amplificaron regiones aleatorias tipo RAPD con seis oligonucleótidos de 10-mer (Amersham Bioscience, UK), y por otra parte se fraccionó con enzimas de restricción de acuerdo a lo informado previamente. Los amplificados aleatorios RAPD se analizaron y correlacionaron con la acumulación de quercetina total, mientras que los fragmentos RFLP se hibridaron con sondas (GT)15 biotiniladas, para capturar fragmentos con secuencias dinucleótidas repetidas. Las bibliotecas tipo RAPD y microsatelitales, se clonaron, secuenciaron, analizaron y de acuerdo con esto se diseñaron oligonucleótidos específicos. Los marcadores de ADN seleccionados se utilizaron en la autentificación de la especie y discriminación con otras plantas morfológicamente semejantes. Resultados. Los estados seleccionados producen el 84% de la guayaba que se cultiva en México. Las muestras de Aguascalientes mostraron la mayor acumulación de quercetina total en primavera, pero en el estado de México se encontró un árbol con la mayor acumulación de quercetina total. Las otras muestras de los estados de Querétaro y Michoacán tuvieron valores inferiores. En el amplificado aleatorio RAPD se usaron seis oligonucleótidos para generar 91 amplificados con una homología entre 74 y 100% entre los individuos. El oligonucleótido 1 generó dos amplificados polimórficos de 560 y 610pb diferenciando los patrones de bandeo 1a, 1b y 1c; el 2 mostró un amplificado polimórfico de 370pb con lo que se diferenciaron los patrones 2a y 2b; el 3 dió un amplificado polimórfico de 690pb que distingue los patrones 3a y 3b; el 4 generó dos amplificados polimórficos de 460 y 480pb diferenciando los patrones de bandeo 4a, 4b y 4c, y los oligonucleótidos 5 y 6 mostraron un solo patrón de bandeo cada uno. El aumento en la acumulación de quercetina se correlaciona con la presencia de los patrones de bandeo 1a y 2a con 4c. De las bibliotecas se obtuvieron 36 secuencias; 5 de ellas con microsatélites dinucleótidos; una similar en un 91% a Arabidopsis thaliana y se logró diseñar oligonucleótidos específicos para 22 secuencias de P. guajava. Se establecieron las condiciones de amplificación para 11 secuencias usando 10 ng de ADN genómico y 1 mM MgCl2 o para 12 secuencias usando 5 ng de ADN genómico y 1.5 mM MgCl2. Cinco de las secuencias seleccionadas fueron exclusivas para P. guajava. Conclusiones. El marcador químico de quercetina, permitió identificar a los individuos del estado de Aguascalientes en primavera como los de mayor acumulación de quercetina. Los marcadores genéticos tipo RAPD 1a y 2a con 4c se correlacionan con un aumento de quercetina con un valor LoD de 9.498 (p<0.05). En la autentificación de la especie los marcadores 1.2A, 4.1, 4.3, 5.8 y 5.5 fueron específicos para P. guajava, permitiendo discriminar la guayaba de otros individuos taxonómicamente similares de la familia Mirtacea.
Introduction. People around the world use medicinal plants to attend their health problems so government and international institutions are now taking attention in quality control methods to guarantee the security and efficiency of plant drug material, avoiding the incorporation of related species that lack the active compound or intrinsically have inhibitory compounds. Official guidelines recognize taxonomic identification and chemical fingerprinting with authenticity tests; however RAPD, RFLP, AFLP, specific-sequence and microsatellital DNA markers are used on species identification and adulterant discrimination in basic preparative research projects. Guava (Psidium guajava L.) leaf is an extensive crop in México and it is used in abdominal disorders, and recently in the treatment of irritable bowel syndrome. Justification. Due to limited genetic information of P. guajava, the purpose of this work was to identify genetic markers related to quercetin accumulation and that allow the authentication of this species to be used in the development of phytodrugs, as a tool of quality control. Hypothesis. Some genetic variations between individuals of P. guajava cultivated in different states from Mexico are associated with a variation in the accumulation of flavonoids while conserved regions are associated with the identification of the species. Objectives. a) To characterize varieties or homologies in RAPD fragments sequences from P. guajava DNA; b) To obtain a dinucleotide microsatellite genomic library from P. guajava L. Material and methods. Young clean leaves of 40 trees where collected from four Mexican states and processed for DNA genomic and quercetin extraction. The raw material was used to obtain a methanolic hydrolyzed extract for quercetin quantification by the HPLC technique using RP-18 columns and a PDA detector. On the other hand, it was used for DNA extraction, amplification of random DNA regions by the RAPD technique using 10-mer primers, and to obtain DNA fragments with restriction enzymes. RAPD analysis was correlated with high quercetin accumulation. RFLP fragments were hybridized with biotilinated tandem sequences. RAPD and microsatellites library were cloned, sequenced, analyzed and specific primers were designed. DNA markers were used in authentication and discrimination from other morphologically alike species. Results. Selected states account for 84% of the guava fruit production in Mexico. Spring samples collected from Aguascalientes showed a high quercetin accumulation, but one individual sample from the state of Mexico had the highest. Six decamer commercial RAPD primers generated a total of 91 fragments, sharing 74 ± 100% of bands among collected trees. The oligonucleotide 1 amplified two polymorphic segments of 560 and 610 bp to recognize the 1a, 1b and 1c banding patterns, oligonucleotide 2 amplified one polymorphic segment of 370 bp to recognize the 2a, and 2b banding patterns, oligonucleotide 3 amplified one polymorphic segment of 690 bp to recognize the 3a and 3b banding patterns, oligonucleotide 4 amplified two polymorphic segments of 460 and 480 bp to recognize the 4a, 4b and 4c banding patterns, oligonucleotides 5 and 6 amplified a pattern band each. Quercetin accumulation increase was correlated between 1a and 2a with 4c pattern bands. Thirty-six sequences were obtained from genomic libraries, five of them with tandem regions, one with a similarity of 91% with Arabidopsis thaliana, and only 22 sequences were viable for specific primer design. Amplified conditions were developed for 11 sequences using 10 ng of genomic DNA and 1 mM MgCl2 or 12 sequences using 5 ng of genomic DNA and 1.5 mM MgCl2. Five fragments were specific for P. guajava. Conclusions. The chemical marker quercetin allowed the identification of individuals from Aguascalientes state in spring with the highest accumulation of quercetin among selected regions. The banding patterns 1a and 2a with 4c are correlated with an increase of quercetin with a LoD value of 9.498 (p<0.05). In the authentication of species markers 1.A, 4.1, 4.3, 5.8 and 5.5 amplified for P. guajava, allowing to discriminate against guava from others individuals morphologically similar.
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