Expresión de los ARNm que codifican para las enzimas que biotransforman a la testosterona en células humanas de carcinoma mamario Pubblico Deposited
El cáncer de mama es una neoplasia dependiente de hormonas esteroides sexuales, en la cual los estrógenos juegan un papel relevante en su origen y progresión; sin embargo, la participación de los andrógenos aún es motivo de controversia, ya que los resultados de numerosos estudios realizados en modelos animales demuestran que los andrógenos pueden promover tanto efectos de tipo estimulatorio como inhibitorio sobre el cáncer de mama. Indicando que el efecto inhibitorio inicial, observado después de su administración, estimula posteriormente la proliferación celular. Se ha demostrado plenamente la presencia de andrógenos y de su receptor, tanto en tejido mamario normal como canceroso, así como su biotransformación a estrógenos; sin embargo, la administración de inhibidores de la actividad de la enzima aromatasa en la terapia del cáncer de mama no es capaz de inhibir totalmente la presencia de actividad estrogénica, lo cual podría explicarse por la formación de metabolitos no aromáticos de testosterona (T), los cuales, como ha sido bien demostrado en diversos órganos blanco, son capaces de interactuar con los subtipos del receptor de estrógenos (RE) alfa (REα) y beta (REβ) intracelulares e inducir efectos de tipo estrogénico. Con la finalidad de determinar la capacidad enzimática de las células de carcinoma mamario para biotransformar T en metabolitos 3α,5α-Androstandiol (3α,5α-Adiol) y 3β,5α-Androstandiol (3β,5α-Adiol), se estudió el metabolismo de T isotópicamente marcada con 14C (T-[14C]) en cultivos de células de cáncer de mama humano dependiente de estrógenos (MCF-7), de células de cáncer de mama humano no dependientes de estrógenos (MDA-MB 231) y células de carcinoma cérvico-uterino no dependiente de estrógenos (HeLa) a diferentes concentraciones de sustrato y tiempos de incubación. Los metabolitos formados se identificaron y cuantificaron con la técnica de dilución isotópica inversa, que incluyó cromatografía en placa fina de los extractos orgánicos, en diferentes sistemas de disolventes y recristalizaciones sucesivas de las zonas radiactivas aisladas, hasta la obtención de actividad específica constante. Posteriormente, se estudió en las líneas celulares MCF-7 y MDA-MB 231, la expresión génica de las enzimas 5α-esteroide reductasa tipo 1 (5α-ERasa1) y tipo 2 (5α-ERasa2), así como de la 3α-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3α-HEDasa) y de la 3βhidroxiesteroide deshidrogenasa (3β-HEDasa), todas estas requeridas para reducir el anillo A de la molécula de T y permitir la formación tanto del 3α,5α-Adiol como del 3β,5α-Adiol. Los resultados obtenidos en la presente tesis demostraron un patrón distintivo del metabolismo de T en las células MCF-7, caracterizado por una abundante conversión (48.3%) en androstandioles (Dioles; 3α,5α-Adiol y 3β,5α3β,5α-Adiol), observándose a tiempos cortos (30-60 minutos) la formación de 5αdihidrotestosterona (DHT), producto intermediario obligatorio para la biosíntesis de Dioles. Esto se demostró con la incubación de T en células MCF-7, en presencia de Finasteride (F), un inhibidor competitivo de las 5α-esteroide reductasas (5α-ERasas), que resultó en una disminución significativa en la formación de DHT y, en consecuencia, la de los Dioles. La bioconversión de T en Dioles en las células MCF-7 fue dependiente tanto de la concentración del sustrato, como del tiempo de incubación. En contraste con los resultados obtenidos en las células MCF-7, en las células MDA-MB 231 se observó una muy limitada bioconversión de T a sus metabolitos 5α-reducidos, mientras que las células HeLa fueron incapaces de formar Dioles, aún a los tiempos de incubación más prolongados. Los resultados de la expresión génica de las enzimas demostraron que la expresión del ARNm que codifica a la 5α-ERasa1 (gen: SRD5A1) en las células MCF-7 fue 1.5 veces mayor que en las células MDA-MB 231, sin embargo, la expresión del ARNm de 3α-HEDasa (gen: AKR1C2), y del ARNm de la 3βHEDasa (gen: AKR1C1) en ambas líneas celulares, no mostró diferencias significativas (p>0.05). El análisis integral de los resultados obtenidos demuestra que la gran formación de Dioles, a partir de T, en las células MCF-7 es el efecto de la potente actividad de las 5α-ERasa1 y de su vinculada sobre expresión del ARNm, con el objeto de iniciar un proceso celular intrínseco para la formación de los metabolitos no fenólicos que podrían activar la proliferación celular, explicándose así el controvertido efecto de la T en la progresión del cáncer mamario humano.
Breast cancer is a sex hormone-dependent neoplasia. It has clearly been shown that estrogens play an important role on its origin and progression. However, the involvement of androgens has remained controversial, since numerous studies in animal models show that androgens can induce both stimulatory and inhibitory effects on breast cancer cell growth or that initial inhibitory effects are followed by an increase on cell proliferation. Even it has been demonstrated that the presence of androgens and their receptor in both normal and cancer tissues, as well as their biotransformation to estrogens, the administration of aromatase enzyme inhibitors used in breast cancer therapies cannot fully preclude the estrogenic activity, a phenomena that can be partially explained by the production of non-aromatic metabolites of testosterone (T), which have been shown to interact to both subtypes of the estrogen receptor (ER) alpha (ERα) and beta (ERβ) and exerting estrogenic-like effects. With the aim to determine the enzymatic potential of carcinoma cell lines to biotransform T into tetrahydro-reduced metabolites of T, androstanediols (Diols): 3α,5α-Androstanediol (3α,5α-Adiol) and 3β,5α-Androstanediol (3β,5α-Adiol), the present study studied the metabolism of [14C] T in breast cancer, estrogendependent cells (MCF-7), breast cancer, non-estrogen-dependent cells (MDA-MB 231) and non-estrogen-dependent, uterine carcinoma cell line (HeLa) at different substrate concentrations and time incubation periods. T metabolites were identified and quantified by a reverse isotope dilution technique, which included thin layer chromatography of organic extracts in different solvent systems and successive recrystallizations of radioactive zones up to obtain a constant specific activity. On the other hand, gene expression of A-ring testosterone reducing enzymes were measured on MCF-7 and MDA-MB-231 cells, including human steroid 5-alpha-reductase type-1 (5α-SRase1), type 2 (5αSRase2), 3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase (3α-HDase) and 3-beta hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HDase). Results demonstrated that a distinctive pattern of T metabolism was identified in MCF-7 cells, characterized by the abundant bioconversion to androstanediols (48.3%), with the preceding formation of 5-alphadihydrotestosterone (DHT), as obligate intermediary. Cell incubation in the presence of Finasteride (F), a competitive inhibitor of 5-alpha-reductases enzymes (5α-SRases), abolished drastically DHT and, consequently, Diols formation. There were both a substrate concentration and a time dependent biotransformation of T to 3α,5α-Adiol and 3β,5α-Adiol metabolites. Opposite to the results obtained in MCF-7 cells, the MDA-MB 231 cell line presented a limited T metabolism to its 5-alpha-reduced metabolites, whereas HeLa cells were unable at all to produce Diols, even at the longest incubation periods of time studied. Gene expression experiments showed that MCF-7 cell presented higher (1.5-fold) 5α-SRase1-mRNA synthesis (gen: SRD5A1) compared to MDA-MB 231 cells; nevertheless, 3α-HDase-mRNA (gen: AKR1C2) and 3β-HDase-mRNA (gen: AKR1C1) expression levels were similar in both cell lines, with no statistic differences (p>0.05). The overall results demonstrated that MCF-7 cells exhibit enhanced expression and activity of androgen-metabolizing enzymes, particularly the 5αSRase1 enzyme, leading to rapid and large Diols formation. These data suggest that Diols formation could somewhat explain the debate of the paradoxical effects of T on human breast cancer cell progression.
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