Obtención de betalaínas en variantes de Stenocereus stellatus y su encapsulación en coacervados complejos Público Deposited
El trabajo experimental fue dividido en dos etapas principales. La primera etapa consistió en la adquisición de los frutos de S. stellatus en huertas ubicadas en la región de San Juan Joluxtla, municipio de Cosoltepec, Oaxaca, México. Cabe mencionar que la clasificación de color de los frutos se basó en la experiencia de los cultivadores, debido a que no existe un precedente técnico que permita diferenciarlos entre sí. Los frutos fueron identificados de manera visual de acuerdo con la coloración de la pulpa como: T1-blanco, T2-rojo, T3-púrpura y T4-naranja. Posteriormente fueron caracterizados molecularmente mediante el uso de marcadores cloroplásticos como psbA-trnH y matK, con el fin de obtener una identificación molecular para cada color, logrando diferenciar las secuencias de los cuatro colores y con ello proporcionar información básica sobre la relación y/o diferencia entre las variantes, y con ello establecer si éstas pertenecen a la misma especie, así como la relación del color exhibido durante la maduración del fruto con modificaciones epigenéticas. Aunado al uso de dichas técnicas moleculares, las diferencias en el color de los frutos permitieron desarrollar un modelo matemático que permita de una forma más estandarizada realizar su clasificación, ya que como se mencionó anteriormente, ésta se basa sólo en la apreciación visual y experiencia del recolector. Este modelo se fundamenta en el perfil de betalaínas, específicamente en los máximos de absorbancia característicos de los dos grupos de compuestos que conforman las betalaínas: betaxantinas (𝜆 = 487 𝑛𝑚)y betacianinas (𝜆 = 536 𝑛𝑚), y mediante la implementación del algoritmo matemático es posible utilizarlo para lograr una clasificación estandarizada de los frutos. Adicionalmente se realizó la caracterización fisicoquímica de los frutos mediante la evaluación del pH, el contenido de sólidos solubles totales (SST), acidez titulable, determinación de azúcares como sacarosa, glucosa y fructosa, contenido de compuestos fenólicos totales, capacidad antioxidante, contenido de flavonoides totales, betalaínas y ácidos orgánicos (ác. cítrico y ác. málico). La caracterización de color se ha realizado mediante la evaluación del contenido de betalaínas en el fruto de S. stellatus y su comparación con extractos de betabel mediante HPLC. Como parte de la evaluación de la actividad funcional, se realizó un ensayo de determinación de actividad anti-hiperglucemiante de la pulpa liofilizada en modelos de rata Wistar. De forma general, a través de este análisis se determinó que el fruto rojo (T2) puede ser utilizado como fuente potencial de betalaínas, dada su mayor concentración (0.38 𝑚𝑔 𝑔𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑟𝑒𝑠𝑐𝑜 −1 ) respecto a las muestras T3 (0.047 𝑚𝑔 𝑔𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑟𝑒𝑠𝑐𝑜 −1 ), T4 (0.019 𝑚𝑔 𝑔𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑟𝑒𝑠𝑐𝑜 −1 ) y T1 (No detectado). Finalmente, la determinación de la actividad biológica determinada mediante la actividad antioxidante y el efecto anti-hiperglucemiante en un modelo de ratas Wistar, mostró que la variante T2 presentó la mayor disminución en los niveles de glucosa en sangre por efecto de la ingesta de pulpa de frutos rojos, obteniendo comportamientos similares a los obtenidos con metformina, medicamento usado para el control de los niveles de glucosa en sangre. En la segunda etapa experimental se planteó la optimización de las condiciones de extracción de los compuestos bioactivos, betalaínas y compuestos fenólicos totales, mediante un diseño de experimentos basado en el efecto del pH, temperatura, tiempo de extracción y solvente sobre el rendimiento de extracción de la concentración de betaxantinas (BX), betacianinas (BC), betalaínas totales (BT), compuestos fenólicos totales (CFT) y capacidad antioxidante (CA), a través de la metodología de superficie de respuesta (MSR). Para esta última etapa también se planteó la estabilización de las betalaínas a través de su encapsulación por el método de coacervación. Todos los factores (pH, temperatura y tiempo de extracción y solvente) influyeron en el rendimiento de las BC, BX y BT, con excepción del tiempo de extracción sobre las BX. En el caso del CFT, tanto el pH como la temperatura favorecieron el rendimiento, siendo pH 4.0 y 60°C, la condición con mayor CFT y CA. La determinación de las condiciones óptimas de extracción buscó maximizar la concentración de BT, CFT y CA, cabe señalar que este proceso no fue posible al considerar un efecto simultáneo, sin embargo, para la extracción de BT, los valores óptimos fueron: pH 4.2, 10°C, 60 min y etanol 55% (v/v), con un rendimiento de 0.51 𝑚𝑔 𝑔𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑟𝑒𝑠𝑐𝑜 −1 . En el caso de CFT y CA las condiciones óptimas de extracción fueron; pH 4.0, 60°C y 10.6 min, con máximos rendimientos de 2.34 mgEAG g-1 y 18.60 μmolTrolox g-1, respectivamente. A partir de estas condiciones de extracción óptimas, se procedió a reducir la degradación de las betalaínas mediante su incorporación en una matriz biopolimérica basada en la formación de complejos coacervados con goma arábiga (GA) y aislado de proteína de suero de leche (PSL). A los coacervados obtenidos se les realizó una caracterización. Se determinó el rendimiento de coacervación, la eficiencia de carga, el potencial 𝜁, espectroscopia infrarroja, y finalmente un análisis de estabilidad térmica. Obteniendo valores de un 60% de rendimiento, una eficiencia del 10%, una condición de pH óptimo de 4, un perfil IR que permitió establecer la interacción entre los biopolímeros para la formación de los coacervados y finalmente observar que el proceso de coacervación es un método efectivo para proteger las betalaínas a la exposición térmica.
The experimental work was divided into two main stages. The first stage consisted of acquiring the fruits of S. stellatus in orchards located in the San Juan Joluxtla region, municipality of Cosoltepec, Oaxaca, Mexico. Color classification of the fruits was based on the experience of the cultivators, since there is no technical precedent that allows them to be differentiated from each other. The fruits were visually identified according to the color of the pulp as: T1-white, T2-red, T3-purple and T4- orange. Subsequently, they were characterized molecularly by using chloroplast markers such as psbA-trnH and matK, obtain a molecular identification for each color, managing to differentiate the sequences of the four colors and thus provide basic information on the relationship and / or difference. between the variants, and thereby establish whether they belong to the same species, as well as the relationship of the color exhibited during the ripening of the fruit with epigenetic modifications. In addition to the use of these molecular techniques, the differences in the color of the fruits allowed the development of a mathematical model that allows a more standardized classification to be carried out, since as mentioned above, it is based only on the visual appreciation and experience of the collector. This model is based on the betalain profile, specifically on the characteristic absorbance maxima of the two groups of compounds that make up betalains: betaxanthin (λ = 487 nm) and betacyanin (λ = 536 nm), and by implementing the algorithm mathematical it is possible to use it to achieve a standardized classification of the fruits. Additionally, the physicochemical characterization of the fruits was carried out by evaluating the pH, the content of total soluble solids (TSS), titratable acidity, determination of sugars such as sucrose, glucose and fructose, content of total phenolic compounds, antioxidant capacity, flavonoid content. total, betalains and organic acids (ascorbic acid, citric acid and malic acid). Color characterization has been carried out by evaluating the betalain content in the fruit of S. stellatus and comparing it with extracts of beet by HPLC. As part of the evaluation of the functional activity, a test to determine the anti-hyperglycemic activity of the lyophilized pulp was performed in Wistar rat models. Through this analysis it was determined that the red fruit (T2) can be used as a potential source of betalains, given its higher concentration (0.38 mg 𝑔𝑓𝑟𝑒𝑠ℎ 𝑤𝑒𝑖𝑔ℎ𝑡 −1 ) compared to the T3 samples (0.047 mg 𝑔𝑓𝑟𝑒𝑠ℎ 𝑤𝑒𝑖𝑔ℎ𝑡 −1 ), T4 (0.019 mg 𝑔𝑓𝑟𝑒𝑠ℎ 𝑤𝑒𝑖𝑔ℎ𝑡 −1 ) and T1 (Not detected). Finally, the determination of the biological activity determined by the antioxidant activity and the anti-hyperglycemic effect in a Wistar rat model, showed that the T2 variant presented the highest antioxidant capacity (CA), as well as the greatest decrease in glucose levels. in blood due to the ingestion of red fruit pulp, obtaining behaviors like those obtained with metformin, a drug used to control blood glucose levels. In the second experimental stage, the optimization of the extraction conditions of bioactive compounds, betalains and total phenolic compounds was proposed, through a design of experiments based on the effect of pH, temperature, extraction time and solvent on the extraction performance of the concentration of betaxanthin (BX), betacyanin (BC), total betalains (BT), total phenolic compounds (CFT) and antioxidant capacity (CA), through the response surface methodology (MSR). For this stage, the stabilization of betalains through their encapsulation by the coacervation method was also proposed. All the factors (pH, temperature and extraction time and solvent) influenced the performance of the BC, BX and BT, with the exception of the extraction time on the BX. In the case of CFT, both pH and temperature favored performance, with pH 4.0 and 60 ° C being the condition with the highest CFT and CA. The determination of the optimal extraction conditions sought to maximize the concentration of BT, CFT and CA, it should be noted that this process was not possible when considering a simultaneous effect, however for the extraction of BT, the optimal values were pH 4.2, 10 ° C, 60 min and ethanol 55% (v / v), with a yield of 0.51 mg 𝑔𝑓𝑟𝑒𝑠ℎ 𝑤𝑒𝑖𝑔ℎ𝑡 −1 . In the case of CFT and CA the optimal extraction conditions were pH 4.0, 60 ° C and 10.6 min, with maximum yields of 2.34 mgEAG g-1 and 18.60 μmolTrolox g-1, respectively. From these optimal extraction conditions, the degradation of betalains was reduced by incorporating them into a biopolymeric matrix based on the formation of coacervated complexes with gum arabic (GA) and whey protein isolate (WPI). A characterization was carried out on the coacervates obtained. Coacervation performance, loading efficiency, ζ potential, infrared spectroscopy, and the thermal stability analysis were determined. Obtaining values of 60% yield, an efficiency of 10%, an optimum pH condition of 4, an IR profile that allowed to establish the interaction between the biopolymers for the formation of the coacervates and finally to observe that the coacervation process is an effective method to protect betalains from thermal exposure.
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