Efecto de una mutación de mimetismo alcalino en el factor de transcripción PacC de Acremonium chrysogenum sobre la producción de antibióticos beta-lactámicos Public Deposited
Cephalosporin C (CPC) belongs to the beta-lactam antibiotics group, which are currently the most prescribed antimicrobials, and economically the most important drugs. This compound is the core of overall semisynthetic cephalosporins for clinical use. Cephalosporins have low toxicity and wide spectrum against Gram-negative and Grampositive bacteria, in small concentrations. CPC is exclusively produced by the filamentous fungus Acremonium chrysogenum. The biosynthesis pathway of CPC is strongly regulated by environmental pH signaling through transcription factor PacC. When environmental pH is acidic to neutral, transcription factor PacC (621 aminoacid residues) has a closed conformation. When environmental pH becomes alkaline, a signal transduction pathway is activated which results in processing of PacC by two successive proteolytic steps, turning it to an active form (~ 250 aminoacid residues). At this point, activated PacC migrates to nucleus and stimulates the transcription of the majority of the CPC biosynthetic genes. In this work, using genetic engineering techniques, we designed a mutation in the A. chrysogenum transcription factor PacC, removing 366 aminoacid residues from the Cterminal end, so that the mutated pacC resulted directly in its active form. Mutated PacC was expressed in A. chrysogenum wild type under the control of a constitutive promoter and its own promoter, with the aim to demonstrate the hypothesis that this mutation would allow an alkaline mimicking phenotype, so that we could obtain an increase of beta-lactams titers, including CPC, irrespective of the pH values in the fermentation broth. We obtained eleven strains with our mutation, and three of them showed a significant increase of beta-lactams production, in comparison with the parental strain, both in alkaline fermentation medium or in acidic buffered medium. In this way, the majority of the mutated strains showed higher levels than parental strain, in a chemically defined medium whith pH buffered to 5.5. These results confirm that our genetic engineering strategy increased significantly beta-lactams production in A. chrysogenum wild type.
La cefalosporina C (CPC) pertenece al grupo de antibióticos beta-lactámicos, los compuestos antimicrobianos más prescritos en la actualidad y los más importantes desde el punto de vista económico. La CPC es la base de las cefalosporinas semisintéticas de uso clínico, un grupo de antibióticos de amplio espectro y baja toxicidad, altamente efectivos contra microorganismos Gram-negativos y Gram-positivos, en concentraciones relativamente bajas. Actualmente, la CPC se produce exclusivamente a partir del hongo filamentoso Acremonium chrysogenum y su biosíntesis se encuentra regulada, entre otros mecanismos, por el factor de transcripción PacC, a través de la señalización por pH ambiental. Cuando las condiciones de pH ambiental son ácidas a neutras, el factor de transcripción PacC, con 621 residuos de aminoácidos, se encuentra en una conformación cerrada. Cuando las condiciones cambian a alcalinas ocurre toda una cascada de eventos que concluye en dos rompimientos proteolíticos sucesivos del factor de transcripción PacC, dejándolo en su forma activa, de aproximadamente 250 residuos de aminoácidos. Una vez activado, PacC se dirige al núcleo y promueve la transcripción de la mayoría de los genes involucrados en la biosíntesis de CPC. En el presente trabajo se realizó, mediante técnicas de ingeniería genética, una eliminación de 366 residuos de aminoácidos del extremo carboxilo terminal en el factor de transcripción PacC de A. chrysogenum, de manera que la mutación generara directamente la forma activa de PacC. La mutación se expresó en la cepa silvestre de A. chrysogenum bajo el control de un promotor constitutivo y del propio promotor del gen pacC, con la hipótesis de que la mutación introducida conduciría a un fenotipo de mimetismo alcalino y, por lo tanto, se podría observar un aumento en la producción de antibióticos beta-lactámicos, incluyendo la producción de CPC, aún cuando los valores de pH fuesen ácidos. Como resultado, se obtuvieron once cepas portadoras de la mutación, de las cuales tres mostraron un incremento significativo en la producción de antibióticos betalactámicos en comparación con la cepa parental, tanto en un medio de fermentación con pH alcalino, como en uno amortiguado a pH ácido. Así mismo, la mayoría de las cepas mutantes mostraron niveles de producción superiores a la cepa parental, utilizando un medio definido con pH amortiguado a 5.5. Se confirma así que la estrategia empleada permitió mejorar significativamente la producción de antibióticos beta-lactámicos en una cepa silvestre de A. chrysogenum.
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