Purificación parcial de una lipasa fúngica Public Deposited
Las lipasas son biocatalizadores ampliamente usados en diversas ramas industriales así como en el sector salud debido a su gran variedad catalítica entre las que se le atribuyen esterificación, transesterificación, acidolisis, alcohólisis y aminolisis. Dada su importancia, es el interés de producirlas y obtener de ellas sus mejores cualidades catalíticas para el fin particular que se persiga, de esta forma también se hace importante la caracterización de estas enzimas. El objetivo de esté trabajo fue producir, purificar y caracterizar parcialmente una lipasa fúngica extracelular. Para la producción fue utilizado el microorganismo Rhizopus microsporus var. chinensis por fermentación en medio sólido, al extracto lipolítico obtenido fue sometido a dos métodos de concentración preparativa, precipitación fraccionada con sulfato de amonio y ultrafiltración con dos cortes moleculares 30 kDa y 10 kDa con el fin de determinar cual daba el mayor factor de purificación y rendimiento, posterior a la selección del método de concentración se continuo con la metodología de purificación utilizando dos protocolos de separación de proteína. El protocolo 1 consistió en la concentración del extracto por ultrafiltración con corte molecular de 10 kDa, el retenido resultante fue aplicado a una cromatografía de interacción hidrofóbica, las fracciones recuperadas con actividad lipolítica fueron sometidas a una cromatografía de intercambio aniónico. El protocolo 2 consistió en la concentración por ultrafiltración con membrana de 10 kDa, un pasode cromatografía de intercambio aniónico y un paso de cromatografía de intercambio catiónico. El protocolo 2 fue el que proporciono mejores resultados por lo que la lipasa parcialmente purificada obtenida fue la que se utilizo para la caracterización parcial, que consistió en determinar la temperatura y pH óptimos de actividad lipolítica. La técnica de electroforesis fue empleada para observar el grado de avance del método de purificación. Se analizaron diferentes métodos para la determinación de actividad lipolítica entre los que se encuentran los métodos espectrofotométricos oleato de cobre, cinética de hidrólisis de p-nitrofenil palmitato e hidrólisis de p-nitrofenil octanoato y el método de titulación pHstat, con el fin de seleccionar el más exacto, preciso, sensible y seguro. Fue analizada la afinidad por sustrato comparando los sustratos p-nitofenil palmitato y p-nitrofenil octanoato y el efecto del uso de triton-X100. Como resultados se obtuvo una mejor resolución con el protocolo 2 de purificación del cual se desprenden un factor de purificación de 6.0 veces, con un rendimiento de recuperación de 4.68 %, la lipasa obtenida tiene mayor afinidad por p-nitrofenil octanoato y el uso de triton-X100 0.0012 % p/v favorece en un 28 % la actividad lipolítica. Con respecto a la caracterización, la enzima parcialmente purificada tiene un pH óptimo de 7.0 y una temperatura óptima de 40 ºC.
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