Estudio químico biodirigido de Cucurbita ficifolia Bouché en modelos hipoglucémicos y antihiperglucémicos: análisis in vivo, in vitro e in silico Público Deposited
Introducción La diabetes mellitus tiene como característica principal un estado sostenido de hiperglucemia, resultante de una deficiente secreción de insulina por parte de las células β-pancreáticas, resistencia a su acción en tejidos diana, o ambas. Se trata de un padecimiento complejo que involucra diversas alteraciones metabólicas. Cucurbita ficifolia Bouché es una especie vegetal utilizada comúnmente como antidiabético dentro de la medicina tradicional mexicana. En estudios previos ha mostrado efectos hipoglucemiante, antioxidante y antinflamatorio, entre otros. A pesar de ello, aún no se cuenta con un análisis fitoquímico biodirigido que permita conocer los compuestos bioactivos y responsables de estas acciones, en particular de la acción hipoglucemiante. Dentro de los puntos clave en la regulación de la glucosa, existen tejidos clave como el músculo esquelético, el tejido adiposo, el páncreas y el hígado, cada uno de ellos involucrado en actividades como la oxidación, el almacenamiento de energía y la producción de insulina. Por ello, las células que conforman estos tejidos representan modelos biológicos útiles para llevar a cabo un fraccionamiento biodirigido a partir del extracto activo de C. ficifolia. Material y métodos Se obtuvieron tres preparaciones a partir de C. ficifolia utilizando disolventes de distinta polaridad: extracto acetónico, extracto acuoso y bipartición del extracto acuoso en acetato de etilo denominada fracción de AcOEt. Se evaluó su efecto hipoglucémico y antihiperglucémico in vivo para seleccionar el extracto o fracción más activa y realizar su fraccionamiento por cromatografía. Las fracciones y subfracciones se sometieron a bioensayos in vitro: en células pancreáticas RINm5F para evaluar su efecto sobre la secreción de insulina y en miocitos C2C12 para evaluar la expresión del ARNm de GLUT-4. Ambos modelos fueron empleados como modelos de monitoreo para llevar a cabo una separación guiada, así como la purificación e identificación de los compuestos presentes en la fracción activa. Los compuestos identificados fueron también evaluados en estos mismos ensayos biológicos, así como en células HepG2 para evaluar su efecto sobre la acumulación de glucógeno y en un modelo in vivo usando ratones diabéticos. Además, con los compuestos identificados se realizó un análisis de acoplamiento molecular sobre los receptores PPARγ y GPR40. Resultados La fracción de acetato de etilo derivada del extracto acuoso mostró efecto hipoglucemiante en el modelo agudo y un contundente efecto antihiperglucemiante en la prueba de tolerancia a la glucosa oral, por lo que se procedió a la separación química de sus componentes. Las fracciones y subfracciones obtenidas se evaluaron en modelos in vivo e in vitro y a partir de ellas se logró identificar los compuestos β-sitosterol y ácido 4- hidroxibenzoico, que mostraron acción dual sobre la expresión de GLUT-4 y secreción de insulina, así como incremento en la expresión de adiponectina y PPARγ, además de incremento en la deposición de glucógeno en células hepáticas. β-sitosterol mostró efecto antihiperglucémico, mientras que el ácido 4- hidroxibenzoico exhibió mayor efecto hipoglucémico en ratones diabéticos. En los estudios in silico, ambos compuestos mostraron potencial como agonistas parciales de receptores GPR40 y PPARγ. Conclusión A través de un fraccionamiento químico guiado por ensayos biológicos se identificaron los compuestos β-sitosterol y ácido 4-hidroxibenzoico como los compuestos mayoritarios de la fracción de acetato de etilo de C. ficifolia, los cuales mostraron acción secretagoga de insulina y acción agonista sobre PPARγ, además de efecto sobre la deposición de glucógeno. Estos compuestos podrían explicar, en parte, los efectos hipoglucemiante y antihiperglucémico de C. ficifolia, representando dos entidades químicas significantes para el diseño de nuevos fármacos con múltiples blancos moleculares con utilidad en el tratamiento de enfermedades metabólicas.
Introduction Diabetes mellitus comprises a wide range of metabolic diseases and is mainly characterized by a chronic state of hyperglycemia, resulting from defects on the secretion and action of the insulin in peripheral tissues. Chronic hyperglycemia is associated with disfunction and damage on the long term, such as organic failure, especially eyes, kidneys, nerves, heart, and vascular system. Cucurbita ficifolia Bouché is a plant commonly used in traditional Mexican medicine to treat diabetes mellitus. In previous studies it has shown diverse effects such as hypoglycemic, antioxidant, and antinflammatory. However, there is still no phytochemical analysis that will allow the identification of bioactive compounds responsible for their hypoglycaemic effect. Among the key points in glucose regulation are the cells of the skeletal muscle, adipose tissue, pancreas and liver, which are involved in activities such as oxidation, energy storage, and insulin production. These cells can serve as biological models for performing a chemical fractionation guided by bioessay of the active extract of C. ficifolia. Material and methods Three extracts of different polarity of C. ficifolia were obtained: acetonic extract, aqueous extract, and a bipartition of the aqueous extract in ethyl acetate (AcOEt fraction). The hypoglycemic and antihyperglycemic effects of these extracts were evaluated in models in vivo to select the most active extract or fraction and carry out a chromatographic fractionation. The fractions and subfractions were subjected to bioassays in RINm5F pancreatic cells to evaluate their effect on insulin secretion, as well as in C2C12 myoblasts to evaluate the expression of GLUT-4 mRNA. Both were used as monitoring models to perform a guided separation, as well as the purification and identification of chemical compounds. The identified compounds were also evaluated in these in vitro models, and in HepG2 cells to evaluate effect on glycogen accumulation, as well as in diabetic mice. In addition, with the identified compounds, a molecular docking analysis on PPARγ and GPR40 was conducted. Results Aqueous extract exhibited hypoglycemic effect in an acute In vivo model. Ethyl acetate fraction derived from aqueous extract showed a robust antihyperglycemic effect in oral glucose tolerance test (OGTT) and was further fractionated. Chemical separation of fractions was guided by biological In vitro activity over GLUT-4 expression in C2C12 muscular cells, and insulin secretion in RINm5F pancreatic cells. The fractions and subfractions that increased expression of glucose transporter GLUT-4, and insulin secretion, were further separated and analyzed. βsitosterol and 4-hydroxybenzoic acid were identified as active compounds of ethyl acetate fraction and active subfractions. Isolated compounds were evaluated In vitro and found to increase both insulin secretion and GLUT4 mRNA expression. Additionally, compounds increased glycogen synthesis in HepG2 cells, β-sitosterol exhibited an antihyperglycemic effect, on oral glucose tolerance test in diabetic mice, while 4-hydroxybenzoic acid had a hypoglycemic effect in acute In vivo model. Molecular docking revealed potential as partial agonists over GPR40 and PPARγ receptors. Conclusion Through a method guided by biological assays, β-sitosterol and 4-hydroxybenzoic acid were identified as majoritarian compounds in an ethyl acetate fraction of C. ficifolia, with insulin secretagogue action and agonist action on PPARγ, showing an effect on glycogen deposition. These compounds could be associated with the hypoglycemic and antihyperglycemic effects exerted by C. ficifolia. Both compounds represent important chemical entities for the design of new drugs with multiple molecular targets and utility in the treatment of metabolic diseases.
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