Efecto de los insecticidas diazinón y malatión durante la fertilización in vitro en ovocitos de cerdo Public Deposited
Entre los agentes químicos comúnmente usados de manera indiscriminada se encuentran los insecticidas que se utilizan para combatir plagas que atacan y destruyen los cultivos. Estos compuestos pueden contaminar directamente por periodos prolongados a las personas, poniendo en riesgo su salud. Entre los principales insecticidas usados en nuestro país que son altamente tóxicos, se encuentran los organofosforados (OF) como el diazinón y malatión. La mayoría de los estudios sobre los efectos tóxicos que estos plaguicidas pueden producir sobre la fertilización se han realizado in vivo en roedores y existen pocos trabajos in vitro. La importancia de realizar estudios de toxicología reproductiva in vitro, radica en la necesidad de conocer los mecanismos por los cuales los insecticidas OF afectan el proceso de la fertilización. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del diazinón y malatión en la fertilización in vitro (FIV) en cerdo. Los ovarios se obtuvieron de cerdas recién sacrificadas y los folículos se puncionaron para la obtención de los complejos ovocitos células del cúmulus. La maduración se realizó en medio TCM-199 suplementado, durante 44 h a 39°C con 5% de CO2 y humedad a saturación. Para la FIV, los ovocitos se transfirieron a TBM modificado con concentración de 0, 50, 100 y 500 µM de diazinón y 0, 50, 100, 500, 750 y 1000 µM de malatión. Los ovocitos se coincubaron en las condiciones descritas anteriormente con los espermatozoides a una concentración final de 5 x 105 espermatozoides/ml durante 7 h y se transfirieron a medio de desarrollo embrionario NCSU-23 por 12 h. Para evaluar el efecto de los insecticidas sobre la viabilidad, los ovocitos fertilizados se incubaron con tetrazolio (MTT) durante 2 h, considerando como vivos a los ovocitos que presentaron coloración morada y muertos a los no teñidos. Para evaluar la FIV, los ovocitos se fijaron, se tiñeron con orceína acética y se evaluaron al microscopio de contraste de fases. En este estudio se observó que el diazinón, no produjo daño en la viabilidad de los ovocitos en ninguna de las concentraciones. En la FIV, los porcentajes de fertilización disminuyeron conforme aumentó la concentración del diazinón, pero solo hubo diferencia significativa en las concentraciones de 100 y 500 mM (p <0.05). Los resultados indican que el diazinón solo tuvo efecto sobre la FIV. El malatión no mostró daño sobre la viabilidad de los ovocitos inseminados, pero afectó la penetración espermática a medida que aumentó la concentración del insecticida, con diferencia significativa en las concentraciones de 500, 750 mM y 1000 mM (p < 0.05), por lo que afectó a la fertilización de los ovocitos. Durante la fertilización se pueden alterar distintos mecanismos como la reacción acrosomal, la unión de los espermatozoides a la zona pelúcida, la fusión del espermatozoide con el ovocito o la descondensación del núcleo espermático. Es importante realizar estudios complementarios en los que se analicen los mecanismos por los que se inhibe el proceso de la fertilización con estos insecticidas. Actualmente se están realizando estudios sobre el efecto de estos insecticidas en espermatozoides, desarrollo embrionario temprano y expresión génica de ovocitos porcinos. Palabras clave: fertilización in vitro, ovocito, porcino, malatión, diazinón.
Among the chemical agents commonly used without control are the insecticides that are used to fight plagues that attack and destroy crops. These compounds can directly contaminate people during prolonged periods, risking their health. Among the main insecticides used in our country, which are highly toxic, are the organophosphates (OP), such as diazinon and malathion. Most of the studies about the toxic effect that these pesticides can produce on fertilization have been made in vivo, in rodents, and there are few in vitro studies. The importance of performing studies of reproductive toxicology in vitro, is the need to know the mechanisms by which OP insecticides affect the fertilization process. The aim of this work was to evaluate the effect of diazinon and malathion on in vitro fertilization (IVF) in pigs. Ovaries were collected from slaughtered prepubertal gilts and follicles were punctured to obtain oocyte-cumulus cells complexes. Maturation was peformed in supplemented TCM-199 during 44 h to 39 oC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air. For IVF, oocytes were transferred to modified TBM with concentrations of 0, 50, 100 and 500 µM of diazinon and 0, 50, 100, 750 and 1000 µM of malathion. Oocytes were coincubated with sperm, under the previously described conditions, at a final concentration of 5 x105 sperm / ml for 7 h and then they were transferred to embryo culture medium NCSU-23 for 12 h. To evaluate the effect of insecticides on viability, the fertilized oocytes were incubated with tetrazolium (MTT) for 12 h, considering alive those oocytes with purple coloration and dead the colorless ones. To assess IVF, oocytes were fixed and dyed with acetorceine and evaluated under phase-contrast microscopy. In the present study it was observed that diazinon did not affect oocyte viability in neither one of the concentrations. In IVF, the fertilization rate decreased as diazinon concentration increased, but differences were only significant at the 100 and 500 µM concentrations (p < 0.05). These results indicate that diazinon only had effect on IVF. Malathion did not affect the inseminated oocytes viability, but affected sperm penetration as insecticide concentration increased, with significant differences at 500, 750 and 1000 µM concentrations (p< 0.05), affecting oocyte fertilization. During fertilization, different mechanisms can be altered, such as acrosome reaction, sperm-zona pellucida binding, sperm-oocyte fusion, or sperm nucleus decondensation. It is important to perform complementary studies to analyze the mechanisms by which these insecticides inhibit the fertilization process. At the moment, studies are being carried out, on the effect of these insecticides on spermatozoa, early embryonic development and gene expression in porcine oocytes. Key words: In vitro fertilization, oocyte, porcine, malathion, diazinon.
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