Expresión heteróloga y caracterización bioquímica de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Giardia lamblia como posible candidata para el diseño de fármacos contra la giardiasis Público Deposited
Incluye referencias bibliográficas: páginas 51-59. Las infecciones parasitarias constituyen uno de los principales problemas de salud pública en México, la giardiasis es una de estas infecciones causada por el protozoario Giardia lamblia, que emplea principalmente la glucólisis para la producción de energía. La glucólisis es una vía metabólica importante para la mayoría de los organismos, incluidos los protozoarios como Giardia lamblia. Muchos de estos eucariotas primitivos han optimizado su metabolismo, favoreciendo la glucólisis para generar ATP en entornos ricos en glucosa en los que residen. La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) es una enzima que participa en la vía de la glucólisis. Esta enzima utiliza gliceraldehído-3-fosfato como sustrato y durante su catálisis se forman el cofactor reducido NADH + H+ y 1,3-bisfosfoglicerato, un intermediario esencial para la generación de energía. Dada la relevancia de la enzima, el objetivo del presente trabajo fue la caracterización bioquímica de la proteína GlGAPDH-I y contrastar sus diferencias con la HsGAPDH de Homo sapiens por alineamiento de secuencia y estructura para considerarla un posible candidato en el diseño de fármacos. Para ello, se propuso aislar el gen glgapdh-I de Giardia lamblia, clonarlo y sobreexpresar la proteína. La expresión se hizo en Escherichia coli, y debido a que GlGAPDH-I contenía una etiqueta de seis histidinas, fue posible purificarla en un paso mediante cromatografía de afinidad. La proteína mostró una masa molecular monomérica de aproximadamente 36 kDa en SDS-PAGE, y la filtración en gel indicó que es un tetrámero. La GlGAPDH-I mostró valores óptimos de pH 7.7 y temperatura óptima de 35–37 °C. También se determinaron los parámetros cinéticos, y los resultados revelaron que GlGAPDH-I muestra una cinética de Michaelis-Menten para el sustrato G3P y la coenzima NAD+, con valores de Km de 0.41 mM y 0.02 mM, respectivamente. El análisis bioinformático permitió identificar motivos conservados característicos de las GAPDH, y el modelo 3D generado de la estructura tetramérica de GlGAPD-I permitió observar la disposición de un fragmento conservado (150-ASCTTNCLAP-159) que contiene los residuos catalíticos Ser151 y Cys-152, altamente conservados en las GAPDH de otros organismos. Finalmente, al comparar GlGAPDH-I por alineamiento de secuencia y estructura con la proteína HsGAPDH, se identificaron motivos conservados característicos de las GAPDH. Sin embargo, el porcentaje de identidad entre ambas secuencias fue de 59.8% y con base en la RMSD de 0.895 la similitud estructural entre ambas topologías es baja. En conclusión, el presente estudio sirve de base para comprender las propiedades bioquímicas de GlGAPDH y una posible propuesta futura como candidata para el diseño de moléculas frente a Giardia lamblia.
Parasitic infections are one of the main public health problems in Mexico. Giardiasis is one of these infections caused by the protozoan Giardia lamblia, which mainly uses glycolysis for energy production. Glycolysis is an important metabolic pathway for most organisms, including protozoans like Giardia lamblia. Many of these primitive eukaryotes have optimized their metabolism, favoring glycolysis to generate ATP in the glucose-rich environments in which they reside. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) participates in the glycolysis pathway. This enzyme uses glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and during its catalysis, the reduced cofactor NADH and 1,3-bisphosphoglycerate, an essential intermediary for energy generation, are formed. Given the relevance of the enzyme, the aim of the present work was the biochemical characterization the GlGAPDH-I protein and to contrast its differences with HsGAPDH from Homo sapiens by sequence alignment and structure in order to consider it as a possible candidate for drug design. For this purpose, it was proposed to isolate the gapdh-I gene from Giardia lamblia, clone it and overexpress the protein. Expression was done in Escherichia coli, and because GlGAPDH-I contains a (His)6-tag, it was possible to purify it in one step by affinity chromatography. The protein showed a monomeric molecular mass of approximately 36 kDa on SDS-PAGE, and the gel filtration experiment indicated that it is a tetramer. The GAPDH showed optimal values of pH 7.7 and temperature of 35–37 °C. The kinetic parameters were also determined, and the results showed that GlGAPDH-I demonstrates Michaelis–Menten kinetics for G3P and NAD+ substrates, with Km values of 0.41 mM and 0.02 mM, respectively. Bioinformatic analysis allowed to identify conserved motifs characteristic of GAPDHs, and the 3D model generated of the tetrameric structure of GlGAPDH-I allowed us to observe the arrangement of a conserved fragment (150- ASCTTNCLAP-159) containing the catalytic residues Ser-152 and Cys-153, which are highly conserved in the GAPDHs of other organisms. Finally, when comparing GlGAPDH-I by sequence and structure alignment with the HsGAPDH protein, conserved motifs characteristic of GAPDHs were identified. However, the percentage of identity between both sequences was 59.8% and based on the RMSD of 0.895 the structural similarity between both topologies is low. In conclusion, the present study serves as a basis to understand the biochemical properties of GAPDH and its possible future proposal as a candidate for the design of molecules against Giardia lamblia.
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